将QIIME2学习进行到底

qiime2-2019.1已经发布，程序稳定性越来越好，鉴于官方已经停止支持qiime1，有必要把qiime2的所有细节都理清，学好，这样才能对自己的数据进行实战分析，并将结果运用于实验和生产过程中。发现文档更新也相当快，感谢公众号宏基因组翻译的文档，让我在看许多专业术语方面扫清不少障碍，但是你介于翻译过来的命令却已经过时，还是对照着看最新版的，基本上很少改动，当然，专业英语好的除外。
发现需要学习的有几个内容，数据的过滤（嵌合体，非细菌序列，注释级别太少的等），还有就是训练一个适合自己的分类参考数据集，另外就是对于一个样本多个时间采样的结果的分析等，下面一个一个来学习。

1.数据的过滤

在分析过程中发现用自己的数据跑出来许多序列只能注释到细菌界，后面不能细分，像这种要过滤掉，刚好发现官方提供了相关的教程和命令，于是直接执行得到结果。教程里面是过滤后保留至少到门的结果，刚好是符合我的需要的，于是参数也不动了。

  #过滤没注释到门的序列
  qiime taxa filter-table \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --p-include p__ \
  --o-filtered-table table-with-phyla.qza

2.训练一个适合自己的分类参考数据集

对于一般的科研项目，扩增使用的多是V3V4通用引物341F和806R，但是不少项目使用的是单独V4的引物515F和806R，而且，就是相同位置的引物，还有简并多少的区别，以及覆盖度的多少。因此，如果不是和官方同样的引物，就有必要训练一个适合项目的参考数据集。下面开始我的步骤：

1）下载并导入参考序列

#greengenes_13_8 
wget -c ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
unzip gg_13_8_otus.tar.gz
#或者SILVA
wget -c https://www.arb-silva.de/fileadmin/silva_databases/qiime/Silva_132_release.zip
unzip Silva_132_release.zip #这个数据更新及时，我决定用它试试
#导入参考序列
qiime tools import \
   --type 'FeatureData[Sequence]' \
   --input-path ../SILVA_132_QIIME_release/rep_set/rep_set_16S_only/99/silva_132_99_16S.fna \
   --output-path silva_132_99_16S.qza

<h1>导入物种分类信息</h1>

qiime tools import \
   --type 'FeatureData[Taxonomy]' \
   --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat \
   --input-path ../SILVA_132_QIIME_release/taxonomy/16S_only/99/taxonomy_7_levels.txt  \
   --output-path ref-taxonomy.qza
#提取参考序列，由于数据较大，这步耗时相当长。这里把截取长度设置为126bp，因为我
qiime feature-classifier extract-reads   --i-sequences silva_132_99_16S.qza   --p-f-primer GTGYCAGCMGCCGCGGTAA   --p-r-primer GGACTACNVGGGTWTCTAAT --p-trunc-len 126   --p-min-length 100   --p-max-length 400   --o-reads ref-seqs.qza
#训练Naive Bayes分类器
nohup time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
   --i-reference-reads ref-seqs.qza \
   --i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
   --o-classifier classifier.qza &
 ```
过程相当耗时耗资源，但是对于一台一般的服务器来说不是问题，峰值内存使用在25G+。

<h2>3.通过比对过滤非细菌序列</h2>
这个主要是过滤宿主基因，应该是宏基因组测序中用的较多。
```bash
qiime quality-control exclude-seqs \
  --i-query-sequences query-seqs.qza \
  --i-reference-sequences reference-seqs.qza \
  --p-method blast \
  --p-perc-identity 0.97 \
  --p-perc-query-aligned 0.97 \
  --o-sequence-hits hits.qza \
  --o-sequence-misses misses.qza
qiime feature-table filter-features \
  --i-table query-table.qza \
  --m-metadata-file hits.qza \
  --o-filtered-table no-hits-filtered-table.qza \
  --p-exclude-ids