摘要
结直肠癌(CRC)在世界范围内高度流行，2018年新增病例180多万例。大多数散发性结直肠癌是由息肉样腺瘤发展而来的，在此之前是粘膜内癌(0期)，它可以进展为更恶性的形式。这一进展过程被称为腺瘤-癌序列。早期发现和内镜切除是CRC管理的关键。越来越多的证据表明，肠道微生物与人类CRC的发展有关。对肠道微生物的全面表征对于评估其作为CRC早期诊断标记物的潜力是非常重要的。在这篇综述中，我们总结了CRC相关细菌及其在动物模型、人类细胞系和人类队列中的致癌机制的最新研究。高通量测序技术促进了人类样本中CRC相关细菌的鉴定。介绍了我们对大型日本队列中收集的粪便样本进行的宏基因组和代谢组研究，这些研究揭示了CRC中微生物的阶段特异性表型。此外，我们还讨论了肠道微生物的潜在致癌机制，由此我们可以推断肠道微生物的变化是CRC致癌的多步骤过程中的因果关系。
简介
在日本，结直肠癌(CRC)的死亡率在过去30年中大幅上升，2014年，CRC超过胃癌成为日本最常见的癌症类型之一，CRC发病率居世界首位，西方化的饮食习惯被认为是其致病因素之一，但其内在机制尚未阐明。大多数CRC病例是散发的，遗传性CRC病例占所有CRC病例的<5%。大多数散发性结直肠癌是由息肉样腺瘤发展而来的，在此之前是粘膜内癌(0期)，可以进展为恶性。这种发育过程被称为腺瘤-癌序列，它通过涉及特定突变的多步骤机制发生。
大约有40万亿细菌生活在人体内，肠道细菌的紊乱与各种胃肠道疾病有关，如炎症性肠病。大约2%的CRC与预先存在的炎症有关，即结肠炎相关癌症。在这些情况下，产肠毒素脆弱类杆菌和粘附性侵袭性大肠杆菌菌株NC101被报告与癌症发展有关(表1)。2012年，据报道，牙周病原体核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)在散发性大肠癌病例中与非结肠炎相关的大肠癌有关。我们已经在小鼠模型和人类细胞系中研究了潜在的机制，并将在下面的章节中进行更详细的讨论。后来，随着产生大量宏基因组数据的下一代测序技术的出现，更多与CRC相关的肠道细菌被鉴定出来(表1)。然而，还没有完全阐明肠道微生物的变化是致癌的原因还是结果，或者微生物是否有助于癌症的进展。一些肠道细菌产生基因毒性的代谢物：例如，少数种类的梭状芽孢杆菌产生脱氧胆酸(DCA)和PKS+大肠杆菌菌株产生大肠杆菌。目前关于饮食和肠道残留物作为肠道微生物和致癌之间的潜在联系只是零散的。为了解决这个问题，我们在日本建立了一项大型的人类队列研究，我们收集了来自相同对象的粪便样本和食物频率问卷，并进行了多组学分析，以全面研究与CRC相关的饮食习惯和宏基因组和代谢组数据。
2 | 具核梭杆菌的致癌作用
具核梭杆菌是一种引起牙周炎的革兰氏阴性厌氧口腔细菌。小鼠模型和人细胞系揭示F.nucleatum通过几个代谢途径加速了CRC。Kostic等的研究报道了F.ucleatum通过独立于结肠炎相关CRC的途径在结直肠肿瘤进展中的作用。在APCMin/+小鼠中引入人的F.ucleatum菌分离株导致了肿瘤的多样性和肿瘤浸润性髓系细胞的聚集，但这种细菌没有诱发结肠炎。Han等报道了人类分离株干扰内皮细胞和上皮细胞的作用。后来，他们对F.ucleatum fada蛋白进行了结构分析，发现它与E-cadherin结合，并在人类细胞系中进行了一系列实验，揭示fada-E-cadherin结合导致β-catenin信号的激活并促进细胞增殖。Gur等人发现F.ucleatum Fap2蛋白通过TIGIT抑制受体共同抑制肿瘤杀伤，这些结果表明F.ucleatum*不仅与CRC相关，而且可能在早期癌变阶段加速/促进CRC**。
3 | 基于人类队列研究的高通量序列数据识别结直肠癌相关微生物
16S核糖体RNA基因和鸟枪法宏基因组测序技术促进了人体粪便和组织样品中肠道微生物的定量分析。大型队列研究已经确定了与腺瘤和大肠癌相关的几个物种，包括革兰氏阳性厌氧球菌，如Peptostreptococcus anaerobius，Peptostreptococcus stomatis和Parvimonas micra(表1)。随后的小鼠实验证明了这些物种在CRC中的演化。经偶氮氧甲烷处理的小鼠暴露于厌氧假单胞菌sAPCMin/+小鼠后，肠道异型增生的发生率较高。用P.micra灌胃的APCMin/+小鼠表现出更高的肿瘤负荷。然而，它们的致癌机制尚未完全阐明。与胃癌(主要由单一物种幽门螺杆菌引起)不同，CRC可以受到各种肠道细菌及其共存网络的影响。此外，对这些肠道细菌的免疫反应可能影响致癌。
4日本人群的肠道微生物及其与结直肠癌的关系
大型队列研究已经确定了几种与结直肠癌相关的细菌及其代谢物，主要是在I-IV期病例中；然而，对于粘膜内癌(0期)，即CRC的非常早期阶段，可获得的数据非常有限。此外，尚不清楚这些细菌及其代谢物中报道的变化是否是致癌的致病因素，或者它们是否是微生物适应肿瘤环境的结果。然而，CRC相关的微生物群目前被全球接受为CRC筛查生物标志物，可用作粪便潜血检测的替代方法。
为了应对这些挑战，我们建立了一个庞大的日本队列。我们收集了631名参与者的粪便样本，其中包括多发性息肉样腺瘤患者、粘膜内癌(0期)患者、I-IV期患者和健康对照组，这些患者在日本东京国立癌症中心医院接受结肠镜检查。从这些I-III期患者中28例收集了手术切除肿瘤前后的粪便样本。我们对这些样品进行了全基因组鸟枪宏基因组测序和基于毛细管电泳飞行时间质谱的代谢组学研究，以评估肠道微生物和代谢物的分类和功能特征。此外，关于生活方式的数据来自一份详细的问卷(475个问题项，25页)，该问卷是在日本公共卫生中心的前瞻性研究中使用的问卷基础上开发的。它包括关于食物频率以及已知CRC风险因素(年龄、性别、吸烟习惯和饮酒)的问题。基于宏基因组分析，我们发现肠道微生物丰度中CRC相关变化的三种不同模式(图2)。首先，从0级到更高级阶段，F. nucleatum丰度显著(P<.005)持续升高。这表明F. nucleatum在腺瘤-癌序列的非常早期阶段起作用，这与上述在小鼠模型和人类细胞系中的发现相一致。相反，P.anaerobius，P.stomatis和P.micra主要富集在I/II和III/IV期，肿瘤切除后其丰度降低，这表明这些种可能不是致癌原因，而是适应了癌变环境。其次，我们发现Atopobium parvulum和Actinomyces odontolyticus，其相对丰度高于其他CRC相关细菌，在多发性息肉腺瘤和/或0期显著增加(P<.005)，但在更高阶段没有显著增加(P>.005)。Kasai等人报道了腺瘤癌变患者的粪便样本中存在A. odontolyticus，尽管他们研究中的样本量非常小(n=6)。他们认为这些细菌可能是导致致癌的因素之一，但这一点仍有待验证。第三，丁酸盐生产者(即，Lachnospira multipara和Eubacterium ligens)和长双歧杆菌在几个CRC阶段被耗尽**。大肠杆菌素基因丰度的比较显示不同患者组之间没有显着差异(数据未显示)。
5|产硫细菌损害肠壁屏障功能，引起炎症和肿瘤
Atopobium parvulum是一种革兰氏阳性的专性厌氧菌，经常从人类口腔中分离出来。它与恶臭化合物引起的口臭有关，如挥发性硫化物，包括硫化氢(H2S)。在IL-10-/-小鼠(克罗恩病的一种小鼠模型)中，它通过产生有毒的H2S，被证明与结肠炎有关。研究表明，有缺陷的粘液层会导致炎症性肠病和结直肠癌，肠道细菌可以通过各种方式促进这一过程。H2S是引起粘液屏障损害的因素之一。使用CRC的小鼠模型，Grivennikov等人表明，肿瘤部位屏障功能受损促进了细菌产品的渗透，导致肿瘤浸润细胞中致瘤性细胞因子IL-23和IL-17的激活以及“肿瘤引发的炎症”。在我们的日本队列研究中，在多发性息肉样腺瘤和粘膜内癌(阶段0)的患者中，A.parvulum显示出更高的丰度(图2)，这证实了H2S在肠道中的可能作用。在饮食方面，产硫细菌(如Bilophila wadsworthia，Pyramidobacter spp.)与较高的蛋白质和肉类摄入量有关。
6|脱氧胆酸加速结直肠癌的发生
脱氧胆酸是一种由一组特定的肠道细菌产生的次级胆汁酸。初级胆汁酸是由肝脏中的胆固醇产生并分泌到肠道中的。其中95%通过一种称为肠-肝循环的过程被转运回肝脏。其余的5%逃避这一过程，并被肠道细菌(例如，Hylemonae和Clostridium hiranonis)代谢，主要在结肠中，转化为次生胆汁酸，包括石胆酸和DCA。在过去的几十年中，大量的动物研究表明DCA在胃肠病器官中具有致癌作用。在小鼠模型和人类细胞系中的研究已经确定Wnt信号通路激活是肿瘤促进机制。临床研究表明，大肠癌患者结肠腔内胆汁酸水平较高。此外，胆汁酸是胃癌的致病因素，这就是为什么Billroth II，胃切除术后的重建类型之一，不再被认为是最合适的手术方式。在我们的日本队列研究中的代谢组分析显示，多发性息肉样腺瘤患者的粪便中DCA浓度较高(图3)，这是CRC的前身。上述研究和我们的研究结果支持DCA可能参与非常早期的癌变过程。
7 | 大肠癌肠道微生物的不同阶段特异性表型及其作为癌症预防早期诊断标记物的应用
我们的代谢组研究还显示，与健康对照组相比，处于不同CRC阶段的患者粪便中支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)和芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)的浓度更高(图3)。在一项切除CRC肿瘤的研究中也发现了较高水平的氨基酸，在此基础上，作者讨论了癌细胞中代谢改变的作用。使用来自同一粪便样本的宏基因组和代谢组数据，我们检查了微生物代谢变化，这些变化可能在支链和芳香氨基酸的升高中起作用。我们观察了不同CRC阶段肠道微生物氨基酸代谢能力的动态变化。特别是，我们在0阶段观察到环己二烯基脱水酶基因pheC的较高丰度，以及编码有氧苯乙酸分解代谢途径的基因簇。另一个小组的交叉队列研究也揭示了CRC宏基因组中氨基酸降解途径的富集。总之，这些发现表明肠道细菌和粪便代谢物的变化可能发生在CRC发展的非常早期阶段，并且可能有助于阐明和诊断致癌机制。
在我们的研究中，上述粪便支链氨基酸、苯丙氨酸-9和pheC被确定为区分0期病例和健康对照的最佳评分标志物，提示它们有可能作为早期CRC的非侵入性诊断标志物。这涉及基于饮食的癌症预防策略，即肠道微生物发酵饮食氨基酸可能导致产生有害的代谢物，如苯乙酸、吲哚、对甲酚和N-亚硝基化合物。此外，我们调查了食物频率和结直肠癌分期之间的关系；我们发现多发性息肉样腺瘤和结直肠癌与总膳食纤维和钙摄入量较低有关(图4)。这与日本公共卫生中心基于前瞻性研究的对大约90000名受试者的10年跟踪调查相一致，该研究揭示了高肉、低纤维饮食模式与CRC发病率之间的强烈相关性，以及钙摄入量与CRC发病率之间的负相关关系。在日本公共卫生中心的前瞻性研究背景下，该研究揭示了高肉、低纤维饮食模式与CRC发病率之间的强烈相关性，以及钙摄入量与CRC发病率之间的负相关。然而，肠道微生物功能如何对这些现象做出贡献还需要进一步分析。特别是，低纤维摄入量和低丰度的丁酸盐生产者和B.longum之间的潜在联系需要澄清。
8 | 结论
先前的研究表明，肠道细菌通过各种机制(例如，产生致癌物质，诱导炎症，以及调节宿主信号和免疫系统)参与CRC的发展和进展。特别是，F. nucleatum已被证明通过作用于信号转导途径而促进癌症，这些信号转导途径涉及上皮细胞增殖和癌症免疫机制。在我们的大规模队列研究中，我们收集了宏基因组和宏代谢组的数据，以评估随着CRC的进展，肠道微生物组成和代谢谱如何变化。我们发现CRC相关的细菌(例如，F. nucleatum)和微生物代谢物(例如，DCA)在CRC开始时增加。我们还发现，在癌变的早期，A. parvulum和A. odontolyticus表现出显著的增加。基于这些发现，我们提出了一种癌症微生物群级联；即微生物群阶段特异性参与CRC癌变的多步骤过程图5)。
定期随访健康指标并分析其肠道微生物和代谢物，这样的前瞻性研究将阐明肠道环境与癌变之间的关系。免疫学研究在很大程度上阐明了肠道微生物的致癌机制，而对其代谢物及其致癌作用的生化研究有限。特别是，尚不清楚CRC相关细菌或细菌代谢产物的存在是否对肠上皮细胞产生不利影响。此外，关于饮食习惯如何与促进癌症发展的肠道细菌相关的研究才刚刚开始。进一步的代谢组学和代谢组研究可能为这些问题提供答案。以基因组为基础的用于癌症治疗的精确药物最近进入了临床。我们相信，在不久的将来，关于肠道微生物的累积知识将为基于微生物的精确医学开辟新的可能性。