**Association Between Sulfur-Metabolizing Bacterial Communities in Stool and Risk of Distal Colorectal Cancer in Men **
摘要
背景&目的：硫代谢微生物将膳食中来源的硫转化为有遗传毒性的硫化氢(H2S)，与结直肠癌(CRC)的发生有关。我们确定了一种与粪便中硫代谢菌相关的饮食模式，然后利用一项大型前瞻性男性研究的数据，调查其与CRC发病风险的关系。
方法：我们收集了自1986年以来参加健康专业人员随访研究的51529名男性的数据，历时26年的随访，以确定粪便中的硫代谢菌与结直肠癌风险之间的关系。首先，在307名健康男性的亚队列中，我们分析了队列的粪便宏基因组和转录组，并使用半定量食物频率调查问卷来评估饮食，确定了与硫代谢相关的43种细菌的食物组合。我们使用这些数据开发了硫微生物饮食评分规则。然后我们使用Cox比例风险模型来评估1986年至2012年期间队列合格个体(n=48246)患CRC风险对此模型的依从性。
结果：与高硫微生物饮食评分相关的食物包括增加加工肉类和低热量饮料的消费，以及较少蔬菜和豆类的消费。调整其他风险因素后，硫微生物饮食得分增加与远端结肠癌和直肠癌的风险相关(多变量相对风险，最高与最低四分位数，1.43；95%CI，1.14-1.81；P=0.002)。相反，硫微生物饮食评分与近端结肠癌的风险无关(多变量相对风险，0.86；95%CI，0.65-1.14；P趋势=0.31)。
结论：在对健康专业人员随访研究参与者的分析中，我们发现长期坚持与硫代谢菌相关的饮食模式与远端CRC风险增加有关。需要进一步的研究来确定硫代谢菌如何在CRC发病机制中起作用。
在美国，结直肠癌(CRC)是第三大常见和致命的癌症，大多数新的确诊发生在那些没有明确遗传易感性的人中。因此，通过改变生活方式(如饮食摄入量)来预防疾病是一个高度优先的问题。证据表明饮食是人类肠道微生物群构成和代谢活动的决定因素，但是否通过特定微生物和菌群代谢模式的改变来调节已建立的饮食-CRC关系仍远远未得到研究。
大量的实验表明，硫代谢微生物的存在和活性与硫化氢(H2S)的生成量增加有关。硫代谢微生物，是分类学上一组最常见的细菌，这些细菌及其产生的代谢物与CRC有关，它们代谢有机物质产生能量，同时经常将膳食中的硫还原为H2S，而H2S本身可能导致上皮DNA损伤，促进与炎症和结直肠癌相关的免疫细胞群体的改变。此外，肠源性H2S可能会使胃肠道的粘液双层破碎。这种屏障通常由的二硫键结合在一起，可能被过量的H2S打破。这种突破可能在肿瘤发生之前通过将肠上皮暴露于免疫原腔细菌。
不同的食物可能是这一过程上游的关键投入。富含加工动物肉的饮食，往往以牺牲水果和蔬菜等纤维来源为代价，可能提供更多有利于这些有害细菌增殖的促炎含硫氨基酸。这种饮食模式与CRC的风险增加有关。相反，富含豆科植物或其他蔬菜的饮食可能与硫代谢菌数量的减少有关。这些食物是硫代葡萄糖苷的丰富来源，硫代葡萄糖苷是具有消炎和可能的预防癌症特性的含硫化合物，与大肠癌和癌前腺瘤风险的减少有关。
因此，我们进行了一项新颖的两阶段研究，以阐明硫代谢菌在CRC中的作用。首先，在健康专业人员随访研究(HPFS)嵌套的男性生活方式验证研究(MLV)的307名男性的发展子队列中，通过饮食和下一代测序的纵向粪便采样，我们生成了硫微生物饮食**，这是一种全新的饮食成分模式，与粪便中硫代谢菌的富集相关。然后，我们使用较大的HPFS作为测试队列，前瞻性地将长期坚持这种饮食模式与参与者中发生CRC事件的风险联系起来，我们收集了这些参与者的关于长期饮食和其他相关暴露的详细信息。
结果
发展队列(MLVS)
在我们的307名男性的嵌套队列中，第一次收集粪便时的平均年龄为70.6±4.3岁。他们一般不吸烟，适量饮酒，粪便形态正常（根据Bristol Stool Score）。在取样前12个月，26.6%的参与者曾接触过抗生素，5.2%的参与者在前两个月内进行了肠道准备。我们发现，在年龄(平均年龄71岁)、种族(均为97%的白人)、BMI(25.7 kg/m2)、体力活动(46对50 MET小时/wk)和吸烟状况(1.5对1%当前吸烟者)方面，选择参与MLVS粪便样本收集的人与不参与的人之间没有临床上的重要差异。
从925份粪便样品中提取DNA。340个样本的RNA被逆转录为cDNA，这些样本来自在两个采样期间提供粪便的参与者，并且没有报告过去一年内使用过抗生素(图1)。计算质量控制前后测序深度分别为3.8±1.6GnT(DNA)和1.8±0.7GnT(DNA)和2.8±2.4GnT(RNA)和1.2±1.0GnT(RNA)。经过最低流行和丰度过滤，我们鉴定并保留了139种细菌，其中43种被认为是硫代谢微生物，基于先前的支持性实验证据，加上在它们各自的泛基因组中至少存在两种硫修饰酶(Supp.表3)。

我们发现粪便宏基因组(DNA)中的硫代谢酶的存在与它们的下游表达(来自宏转录组的RNA；图2)之间存在适度的一致性。这表明，用于定义硫代谢微生物的酶子集是合理的代用品，编码这些基因产物的物种的存在通常反映了粪便中人类肠道的潜在硫代谢活性。

使用最接近生物收集的FFQs，使用逐步线性回归后保留的七个食物组的加权和来计算硫微生物饮食得分，对最能预测43种硫代谢菌的丰度对数转换(Supp.表4)。组成食物组是加工肉、白酒和低热量饮料(每种都与硫代谢菌的相对丰度正相关)，以及啤酒、果汁、豆类、混合(其他)蔬菜和甜食/甜点(每种都是负相关的)。
我们发现硫微生物饮食得分与CRC微生物群中的重要物种，两个硫代谢菌的丰度之间存在显著的关系。具体地说，硫磺微生物饮食得分与Erysipelotrichaceae bacterium 21_3**** **和Bilophila wadsworthia**** (图3)的相对富集相关。先前已经证明，在喂食高脂肪饮食的小鼠中和CRC患者中，属于Firmicutes门的Erysipelotrichaceae bacterium 21_3增加。几个Bilophila spp.在CRC和结肠腺瘤前体组织中过度表达，特别是非洲裔美国人患者。

一些硫代谢酶仅由一个物种携带和表达，如Bilophila wadsworthia和EC 1.8.99.3(亚硫酸盐还原酶)，它们主要异化亚硫酸盐还原，也是微生物驱动的H2S生产的重要代理(图4)。相反，诸如EC 2.7.7.4(硫酸盐腺苷转移酶)这样的酶，催化代谢膳食硫和嘌呤的反应，在多种分类的微生物中广泛地共享，包括来自Parabacteroides属，Ruminocccus spp.和Desulfovibrio desfuricans的微生物。这可能表明，通过富集能够代谢硫磺和嘌呤丰富的加工肉类的微生物，群落对底物的可用性的反应，这些是硫微生物饮食的特征。一般来说，对于硫代谢酶，微生物的转录活性与其宏基因组基因水平高度相关，即在DNA上有编码硫代谢酶的物种数量越多，RNA水平对该酶有贡献的物种数量就越多。这一观察表明了这些酶的生物学重要性-当存在时，它们被表达。这支持了评估参与硫生态的整个微生物群落的重要性，而不是比较孤立的几个微生物。

测试队列(HPFS)
在粪便纵向采样期间制定了个人从头开始的饮食模式膳食清单，我们根据连续收集的1986年至2010年每个参与者的FFQ，计算了更大HPFS中个体的硫微生物饮食得分。我们发现，更紧密地坚持硫微生物饮食的参与者倾向于具有稍高的BMI，更频繁地吸烟(现在和过去)，并且更有可能是阿司匹林的经常使用者(表1)。我们试图确保硫微生物饮食不会作为西式饮食的替代措施，这种饮食的特点是高脂肪摄入和缺乏纤维，以及先前与CRC风险相关的摄入模式。尽管共享几个食物组，硫微生物饮食评分与西方饮食评分没有关联(研究基线时，斯皮尔曼ρ=-0.009)，这表明硫微生物饮食评分在良好的饮食-CRC关系中是一种新颖的、独立的评分。
我们记录了在26年的随访中发生的1264例CRC，包括1077325人年。对硫微生物饮食的更多坚持与远端结肠癌和直肠癌的风险增加相关(图5)。与第一个四分位数中的硫磺微生物饮食得分相比，最高四分位数的男性在调整假定的直肠癌风险因素后，多变量RR为1.43(95%CI：1.13，1.81；p=0.002)。相反，没有观察到与近端结直肠癌明显相关(p=0.31)。

由于几个原因，分组的进一步分析值得注意。当比较硫微生物饮食得分的极端四分位数时，无CRC家族史的受试者之间的关联性更强(p-交互作用=0.02；图6)。同样，那些有较低BMI和没有吸烟史的人患远端结肠癌和直肠癌的风险比他们的参考对应者更高。综上所述，这可能表明坚持硫微生物饮食可能对那些先前CRC风险因素很少或没有的人的疾病风险有很大的影响。

结论
我们的研究由男性生活方式验证研究子队列组成，嵌套在更大的前瞻性健康专业人员随访研究中，这提供了一个独特的机会，不仅可以探索硫代谢菌的饮食决定因素，还可以探索这些微生物富集的人类肠道菌群如何与疾病风险相对应。我们使用基于饮食的新指数，硫微生物饮食评分，预测这些细菌的长期富集与增加远端结直肠癌的风险有关。有趣的是，在具有较少传统CRC风险因素的个体中，硫微生物饮食与CRC风险升高的关系更密切。综上所述，我们提供了首个此类证据，将目标微生物组的发现与流行病学范围内饮食驱动的疾病风险差异联系起来，暗示肠道微生物群落是建立良好的饮食与CRC关系的潜在中介。这些结果可能为考虑将饮食调整作为一种手段来调节一系列胃肠道疾病(包括CRC和炎症性肠病(IBD)所涉及的长期生态状态提供理论基础。
我们的主要发现是由一系列长期存在的因素推动的，这些因素将结肠营养与微生物化学联系起来。结肠中的粘液双层将上皮细胞从肠道中的微生物内容物中分离出来。这种典型的无菌强化将高贵的上皮组织与免疫原性高的微生物抗原分离。因此，在CRC和IBD的发展过程中，这个界面的破坏被认为是一个重要的事件。组成这个屏障的粘蛋白通过二硫键连接，它们会在过量的H2S存在下碎裂，H2S是硫代谢的有害副产品。这个至关重要的保护屏障上有了一个缺口。其他的报道已经令人信服地证明了饮食是如何调节整体肠道微生物组成的。先前的横断面证据发现，富含肉类蛋白质的高脂肪饮食可能会促进人体内不同且多样性较低的硫代谢菌种群。加工肉类，硫微生物饮食的关键组成部分，被认为是特别有问题的，因为它们的硫含量很高，来自含硫氨基酸和防腐剂中发现的9种无机硫化物。相比之下，与动物来源不同，以植物为基础的硫源，例如在豆类和蔬菜中发现的硫源，与硫代谢菌的相对减少相关的两种食物，可能包括被称为硫代葡萄糖苷的化合物。非硫代谢细菌可能产生芥子酶，将硫代葡萄糖苷水解成异硫氰酸酯，异硫氰酸酯因其防癌特性而被广泛研究。因此，硫的来源，而不是食物中可量化的硫含量，可能更能预测硫代谢细菌的丰度，这是先前关于总硫含量与CRC风险相关的不一致发现的合理解释。
此外，我们在结直肠远端风险升高的发现符合先前在人类研究中通过解剖部位证明CRC是一种分子异质性疾病的背景，这表明来自大肠近端和远端的癌症之间可能存在病因学上的差异。先前的动物研究已经证明，GI微生物可能改变Toll样受体-2(TLR2)和TLR4在无特定病原体(SPF)非无菌小鼠(因为它们的癌症预防特性被广泛研究)的结肠中区域的差异表达。这些先天免疫标志物的表达，是近端和远端大肠癌之间的病因学差异。其他研究也证明了宿主基因的功能模式可能会被依赖于有利解剖条件的微生物信号改变。氨基酸发酵，包括含硫半胱氨酸和蛋氨酸，可能在远端更多，而不是近端结肠。综上所述，大肠尾部维持免疫和微生物稳态的关键宿主因子减少，并可能促进致病微生物的出现，使远端结肠直肠更容易受到损伤。我们的工作在传统的或成熟的CRC风险因素之外增加了一个新的维度，其归因风险的比例可能是由微生物生态学的生物区域差异所驱动的，即肠道微生物群落的区域和解剖多样性的差异。
这项研究扩展了先前在CRC和肠道微生物群方面的研究，这些研究很大程度上侧重于饮食或孤立的微生物学。然而，一系列较小规模或有时间限制的人类研究，确证实验证据和CRC微生物组的大规模调查（几乎没有关于饮食摄入量的信息），都证实了硫代谢菌的重要性，我们使用全面的文献综述和生物信息学方法进行了鉴定。在一项这样的研究中，连续几天喂食高肉类、高脂肪饮食的参与者胆汁抵抗型硫代谢菌和编码H2S产生酶的微生物DNA和RNA增加。在一大群患有癌前息肉和大肠癌的患者中，沿着腺瘤-癌顺序，存在相对富集的硫代谢微生物，包括***Bilophila和Desulfovibrio spp***，以及与硫相关的代谢途径。
我们的研究有几个优点。首先，我们利用了超过26年的研究人群跟踪，包括具有同期饮食清单和连续粪便取样的发育队列。这使我们能够更全面和纵向地将某些食物的摄入与硫代谢菌的富集和减少联系起来，并随后将这些假定的食物和摄入模式与胃肠道恶性肿瘤的风险联系起来。虽然长期以来一直认为H2S有助于炎症和致癌，但它在结肠环境中以气态、溶解和阴离子形式存在，使其在体内测量具有挑战性。通过观察细菌数量的变化及其与硫生态相关的酶活性，可以绕过这些限制。将宏基因组物种注释与宏转录组功能活性结合起来，目前是H2S遗传毒性效应的最佳可用代理，并使我们能够更有信心地将硫微生物饮食和远端CRC之间观察到的关联归因于硫的微生物代谢，而不是这类细菌也的其他功能。其次，关于饮食摄入量和癌症结果的信息定期更新和前瞻性收集，随访率高，限制回忆和确定的选择偏差。第三，我们还收集了几个CRC已知风险因素的详细信息，这些因素可能会混淆硫微生物饮食和CRC风险之间的关系，并且将它们包含在我们的多变量模型中，并没有显著改变我们的估计。最后，我们能够证明硫代谢菌的存在与它们的功能活性和转录本水平相结合，试图进一步将相关性与潜在的生物学联系起来。
我们承认几个限制。我们的研究由年龄较大的男性健康专业人员组成，尽量减少异质性，并可能受到社会经济状况的影响，这一点特别值得注意。然而，对概括性的关注是最少的，因为我们的观察解决了一种可能的潜在机制，即可能存在于不同人群中的饮食与健康之间的联系。尽管存在这些挑战，我们还是发现了令人信服的证据，表明某些食物可能调节硫代谢菌的存在和活动，可能与能量和底物可用性的差异有关。鉴于我们研究的观察性质，我们不能排除残留混杂的可能性。然而，我们仔细调整了多个潜在的混杂因素。虽然菌株级别的致病潜力和微生物转录差异已经非常稳定，但我们汇编的硫代谢菌列表仅限于物种级别的分类学。这是一个必要的限制，因为我们打算利用细菌的交叉分类来严格和自信地将微生物分类为已知但稀少的硫酶，以及需要事先的、有力的实验证据来证明它们参与硫代谢。最后，我们将分析限制在健康人体肠道中具有足够流行度和丰度的微生物。梭杆菌属只存在于6个粪便样品中(平均相对丰度：2.4×10-3)。这种低出现率与其他对健康人类的大规模调查是一致的。因此，我们的分析并没有特别检查梭杆菌属(Fusobacterium Spp)。相反，梭杆菌在晚期结直肠癌患者中更为丰富，特别是结直肠癌。
饮食调节肠道微生物群作为降低慢性病风险的一种策略具有重要的吸引力。进一步证实我们的发现将从多学科方法中受益，以阐明这些微生物如何影响肠道炎症和肿瘤发生的机制。需要对硫微生物饮食是否影响前体腺瘤病变的风险进行流行病学调查，以及在人体试验中避免食用相关食品，以分别识别危险人群和改善潜在危害的有希望的靶标。我们的发现可能有助于统一先前观察到的硫代谢性微生物和CRC之间的关系，并提供一种合理的机制来支持饮食和CRC风险之间的联系。