纳米孔(Oxford Nanopore)测序仪的学习笔记

最近学习了测序中国探基学院的相关课程,关于纳米孔(Oxford Nanopore)测序仪,由诺禾致源的工作人员主讲,收获了一些知识,在此记录一下。他们讲的内容多了一些实践相关的经验,值得学习。

关于纳米孔测序仪的性能指标

  • 1.准确度已经从R6试剂的70%提升到了现在的95%。
  • 2.建库起始DNA量建议大于10微克。

关于建库方式

  • 1D Ligation 1D + Barcode–损伤修复–末端制备–1D蛋白–PCR-free或者PCR测序(后者适用于样品少的情况)。
  • Rapid 十分钟完成,适用于野外等情况,转座复合体(切DNA)+测序接头直接测序,测序读长会变短。实验室不推荐使用。
  • 未来 R10, Reader Heads *2,读两次,75X测序深度可以达到Q50;
    Flip-Flop,R9--Q37 99.98%,R10,Q42,99.99%,可以看到它的准确性正在逐步提高。
  • LCS共线性的建库方法 类似Pacbio,循环测序一条序列,官方已淘汰

关于提取大片段的DNA

可以使用核分离(10X Genomics的方法),或者琼脂糖包埋(BioNano的方法),使用宽枪头或者把枪头前端剪宽点。

几点经验

  • 1.质量低,上样量低=产出低
  • 2.DNA质量长度要>30kb,并且无胶污污染(应该指的是跑胶没有明亮的蛋白那种残留),不粘稠,Buffer不含表面活性剂,防止堵住纳米孔。
  • 3.如果DNA只有100-500ng,打断处理可以提高产出。

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