找变异流程之snp_call –WES学习之路

参考了许多WES的流程之后,终于学会了几个找变异软件的使用,记在这里备忘一下。学习不可囫囵吞枣,我还是把软件的各个参数理解下,也充实下内容,避免只有代码的尴尬。

1、找变异的前处理

这里主要是对bam文件进行排序,不知道用samtools和picard的差别在哪,但是,02样本用picard会报错的。

对 mapping 得到的 bam 文件做完 Fix Mate Information、Sort 和 mark duplicates 处理后, 就可以进入 GATK 流程了。

BWA 有时会产生不正常的 flag 信息,在进行其它分析前最好先整理 reads 的 mate 信息以及 flags。

SortSam 并没有依据 Mate 信息进行过滤,MarkDuplicates 如果仅仅是标记重复而不移除重复时,不会对 mate 信息产生影响,当时觉得 FixMateInformation 只要在用 GATK 分析之前运行了就可以 (GATK 默认会依据 mate 信息对数据进行过滤)。

如果 MarkDuplicates 这步把重复去掉,则会对 mate 信息产生影响,可以考虑在这步之后加上 FixMateInformation。

picard SortSam SORT_ORDER=coordinate INPUT= Illumina_B1702-sorted.dedup.add.bam OUTPUT= Illumina_B1702.add.sorted.bam
# samtools index Illumina_B1702-sorted.bam 这个也能实现
echo MarkDuplicates
java -Xmx9g -jar ~/miniconda3/share/picard-2.14.1-0/picard.jar MarkDuplicates CREATE_INDEX=true REMOVE_DUPLICATES=True ASSUME_SORTED=True VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT METRICS_FILE=/dev/null INPUT=Illumina_B1702-sorted.bam OUTPUT=Illumina_B1702-sorted.dedup.bam TMP_DIR=/media/biolinux/LENOVO_imcdul/WEA/tmp

echo FixMateInformation
java -Xmx9g -jar ~/miniconda3/share/picard-2.14.1-0/picard.jar FixMateInformation SO=coordinate VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT CREATE_INDEX=true INPUT=Illumina_B1702-sorted.bam OUTPUT=Illumina_B1702-sorted.mate.bam TMP_DIR=/media/biolinux/LENOVO_imcdul/WEA/tmp

2.freebayes

Boston College Biology一个团队开发的,介绍少的可怜,翻译一下文档:

FreeBayes是一个贝叶斯遗传变异的检测器,发现短读顺序比对的小多态性,特别是SNPs(单核苷酸多态性),INDELS(插入和删除),MNPs(多单核苷酸多态性),和复杂的事(复合插入和替换事件)。

参数挺少的,估计默认参数就挺好的。

echo freebayes
nohup freebayes -f ../../../hg38/hg38.fa Illumina_B1702.sort.bam > Illumina_B1702_freebayes.vcf &

-C ,默认值为2,即变异位点处至少有两个和参考碱基不同,才会考虑是snp位点。

-F 默认为0.2 ,即至少有20%的碱基和参考碱基不同才能被call出。假如某位点深度为100,但是只有10个碱基和参考序列不同,是不会被call出的。

3.bcftools

samtools还有个非常重要的命令mpileup,以前为pileup。该命令用于生成bcf文件,再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件,在samtools的安装文件夹中可以找到。

最常用的参数有2:

-f 来输入有索引文件的fasta参考序列; -g 输出到bcf格式。

不使用-u或-g参数时,则不生成二进制的bcf文件,而生成一个文本文件(输出到标准输出)。该文本文件统计了参考序列中每个碱基位点的比对情况;该文件每一行代表了参考序列中某一个碱基位点的比对结果。

Usage: samtools mpileup [-EBug] [-C capQcoef] [-r reg] [-f in.fa] [-l list] [-M capMapQ] [-Q minBaseQ] [-q minMapQ] in.bam [in2.bam [...]]
echo bcftools
nohup samtools mpileup -ugf /media/biolinux/LENOVO_imcdul/hg38/hg38.fa  Illumina_B1702-sorted.bam  |bcftools call -vmO z -o \ Illumina_B1702.bcftools.vcf.gz &

4.varscan

VarScan2是华盛顿大学开发的一款多用途的call变异工具。可用于种系细胞、体细胞(SNV/INDEL/CNV/)(CNV不建议用,据说是别人提供的脚本,漏洞百出)、de Novo Mutations(trios))等。

VarScan2使用各种过滤方法,以得到各位点在样品中的基因型,并计算各等位基因的read 频率。此工具只支持两种等位基因的基因型。通过比较两个样品在该位点各等位基因的read 频率,并通过fisher’s检验得到差异显著性水平p 值。VarScan2工具将突变位点分为三种突变状态:somatic 突变、germline 突变、LOH 突变;并从三种状态的位点,得到置信位点。

生成1个mpileup文件(官方文档强烈推荐)

samtools mpileup -q 1 -d 30000 -L 30000 -f ucsc.hg19.fasta normal.bamtumor.bam > normal.tumor.mpileup

参数说明:-q 1表示跳过比对的mapQ得分<1的碱基

-d 30000表示bam文件的最大测序深度为30000,这是考虑超深度测序的设置

-L 30000表示INDEL序列的最大测序深度为30000,这是考虑超深度测序的设置

echo varscan
samtools mpileup -f ../../../hg38/hg38.fa Illumina_B1702-sorted.bam > Illumina_B1702.mpileup.txt
varscan mpileup2cns Illumina_B1702.mpileup.txt --output-vcf 1 \ 
--variants 1 --min-var-freq 0.01 > Illumina_B1702.vcf

VarScan limit normal.tumor.vcf.snp –regions-file regions.bed –output-file normal.tumor.vcf.target.snp

–regions-file指定靶向测序分析的范围

变异过滤:processSomatic命令

VarScan processSomatic normal.tumor.vcf.target.snp –min-tumor-freq 0.05 –max-normal-freq 0.15–p-value 0.07

参数说明:这里测序深度较深,所以–max-normal-freq0.15设置较大。

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