最近在github上找到一个ubiome的原始数据，包含多个身体部位的，尝试分析一下，看看能获得什么结果。经历了那么多的安装坑，发现还是docker的安装方式最方便有效、节省时间，特别是换上国内的加速源之后。虚拟机太占资源，而且总感觉虚拟机不够真实，conda安装完竟然也总是报错，特别是2个月更新一次，如此频繁的qiime2。

1.docker安装qiime2

#安装docker
sudo apt-get install \
     apt-transport-https \
     ca-certificates \
     curl \
     gnupg2 \
     software-properties-common
curl -fsSL https://download.docker.com/linux/debian/gpg | sudo apt-key add -
sudo add-apt-repository \
    "deb [arch=amd64] https://download.docker.com/linux/ubuntu \
    $(lsb_release -cs) \
   stable"
sudo apt-get update
sudo apt-get install docker-ce
#更新国内DaoCloud 加速源,看教程也有阿里云的
https://www.daocloud.io/mirror#accelerator-doc
##将用户添加到docker组 ,方便使用
#非root用户，不需要使用sudo使用docker，需要将用户添加到docker组sudo groupadd docker
sudo gpasswd -a 用户名 docker
sudo service docker restart
#摘取qiime镜像
sudo docker pull qiime2/core
sudo docker run -t -i --rm -v $(pwd):/data qiime2/core

#这里我们在docker里的工作目录就变成了/data,然后数据的绝对目录就是/data/microbiome

2.原始数据的稍微处理

由于ubiome的测序数据是双向150bp，去除引物得到的单向有效长度是120bp多，而一般V4全长是250bp左右，双向数据是难以拼接的，所以这里就简单把两端数据混在一起分析了，不知道科不科学。ubiome是采用完全比对到SILVA数据库，然后选择完全比对的序列作分析的，这个分析方法还是申请了专利的，有点复杂，这里就按简单的来了。当然，一般分析16S数据是要切去扩增引物的，这里为了简单也省去了。

#首先，下载这些数据：
git clone https://github.com/gedankenstuecke/microbiome.git
cd microbiome
#这里面有两次的肠道菌检测数据，把最近更新的一次数据（SSR_23172 - gut 2 (taken on September 5th, 2015)）的正反向文件合并
zcat  ssr_23172__R1* >> ssr_23172.fastq
zcat  ssr_23172__R2* >> ssr_23172.fastq
gzip  ssr_23172.fastq
mkdir raw_data
mv ssr && mv ssr_23172.fastq.gz raw_data/

3.导入数据

#把数据重新命名成qiime2能识别的命名方式，比如XX_S67_L001_R2_001.fastq，这样直接导入更方便些：
qiime tools import \
--type 'SampleData[SequencesWithQuality]' \
--input-path raw_data \ #你的重命名数据所在的文件夹
--input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt \
--output-path demux-single-end.qza

4.序列质控及Feature表构建

## quality control #visualization 
qiime demux summarize \
 --i-data microbiome.qza\
 --o-visualization microbiome.qzv
 ##filter 聚类
 qiime dada2 denoise-single \
 --i-demultiplexed-seqs microbiome.qza \ 
--p-trunc-left 0 \
 --p-trunc-len 126 \
 --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza #输出feature表代表序列
 --o-table table-dada2.qza \ #输出表 
--p-n-threads 4 \#4线程，服务器是36线程的
 --o-denoising-stats  stats-dada2.qza
 #qzv 可视化 qiime feature-table summarize \
 --i-table table-dada2.qza \
 --o-visualization table-dada2.qzv
#代表序列统计
qiime feature-table tabulate-seqs \
--i-data rep-seqs-dada2.qza \
--o-visualization rep-seqs.qzv
qiime tools view rep-seqs.qzv

5.建树，用于多样性分析

# 多序列比对
qiime alignment mafft \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza
# 移除高变区
qiime alignment mask \
  --i-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza
# 建树
qiime phylogeny fasttree \
  --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza
# 无根树转换为有根树
qiime phylogeny midpoint-root \
  --i-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

6.alpha多样性

qiime diversity core-metrics \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --i-table table.qza \
  --p-sampling-depth 1080 \ 
  --output-dir core-metrics-results
 #物种注释，greengenes13.8 V4区数据注释
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza \
--i-reads rep-seqs-dada2.qza \
--o-classification taxonomy.qza
#可视化看看
qiime metadata tabulate \
  --m-input-file taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv
#画个柱状图，一般人最想要的就是这个图吧
 qiime taxa barplot \
--i-table table-dada2.qza \
--i-taxonomy taxonomy.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization taxa-bar-plots.qzv

 
最后就得到这张漂亮的图啦，我截取了界、门、属和种四个分类级别的柱状图。